透射熒光顯微鏡與反射熒光顯微鏡的區別及優(yōu)缺點(diǎn)

1．透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過(guò)聚光鏡穿過(guò)標本材料來(lái)激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調節反光鏡使激發(fā)光轉射和旁射到標本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強，而缺點(diǎn)是隨放大倍數增加其熒光減弱．所以對觀(guān)察較大的標本材料較好。

2．落射式熒光顯微鏡：這是近代發(fā)展起來(lái)的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45度角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開(kāi)，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿(mǎn)足不同熒光反應產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。

透射熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)

光源：高壓汞燈或鹵素燈。

聚光鏡：使用暗場(chǎng)聚光鏡，使激發(fā)光和熒光分離出來(lái)。

物鏡：可用任何種類(lèi)的物鏡。

標本：因為是透射觀(guān)察，薄的標本比較適合。

優(yōu)點(diǎn)：①由于用了暗場(chǎng)聚光鏡，激發(fā)光不能進(jìn)入物鏡，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差，且任何物鏡都可用于觀(guān)察。②用低倍物鏡時(shí)，比反射熒光顯微鏡更亮。

缺點(diǎn)：必須正確調整聚光鏡中心和高度，否則不能獲得明亮的熒光像。由于暗視場(chǎng)聚光鏡焦距限制，不能使用厚的載玻片。視場(chǎng)照明區不能過(guò)大，否則容易使熒光標本熒光色衰褪。厚的或不透明的標本不適用。

反射熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)
光源：高壓汞燈或鹵素燈。

聚光鏡：因為物鏡作為聚光鏡，所以不需要聚光鏡。

物鏡：所用物鏡必須能透過(guò)足夠的紫外光，而且本身不產(chǎn)生熒光，對數值孔徑?jīng)]有限制。

標本：厚的標本或不透明的標本都能觀(guān)察。

優(yōu)點(diǎn)：①由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調節。②采用柯拉照明法，可利用孔徑光闌和視場(chǎng)光闌的效果。③物鏡數值孔徑不受限制，在高放大倍率時(shí)，也可以獲得高分辨率的像。④厚的或不透明的標本也能觀(guān)察，厚的蓋玻片也能使用。⑤其它觀(guān)察法也能與反射熒光結合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結合。⑥可以避免不必要的熒光色衰褪現象。

缺點(diǎn)：在用地倍率物鏡時(shí)，像比較暗，因此必須用大數值孔徑的物鏡。濾光鏡系統必須有效地分離開(kāi)激發(fā)光和熒光。